×
      歡迎光臨本商城.訂購電話 021-60543596 
您好! [請登錄]   [免費注冊]
提示:如要分類搜索,請點擊高級搜索進行搜索。
全部商品分類

菌種鑒定報告

發布日期:2017-01-07

1 材料與方法

1.1 材料

Taq EP0402 Fermentas

DNA片段膠回收試劑盒AP-GX-50 Axygen

pGEM-T 貨號A3600 Promega

LB培養基   購于上海生工

氨卡青霉素鈉   購于上海生工

1.2 主要儀器

中国福彩网12选5:PCR儀器   ABI 9700PCR

中国福彩网app www.qfhtgo.com.cn 電泳儀    BioRad

高速離心機  Thermo

高壓滅菌鍋   SANYO全自動高壓滅菌鍋

移液器     Thermo

1.3 方法

1.3.1 菌落PCR

使用27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG,1497RGGTTACCTTGTTACGACTT 進行擴增,引物為南京金斯瑞生物科技有限公司合成,儲存濃度為100μm,使用濃度為10μm。按照如下方法混合各種PCR反應溶液:Buffer(Kcl) 2.5μl, 2mMdNTPs 2.5μl,27F 2μl , 1497R 2μl, 25Mm MgCl2 1.5μl, Taq 0.5μl, ddH2O 14μl. 混合后用10μl的吸頭撰取菌液在混和液中攪動一下,然后進行PCR。

PCR反應參數如下:94℃ 4min; 94℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 2min,30循環; 72℃ 10min。PCR結束后,1%瓊脂糖鑒定,并使用Axygen AP-GX-50 DNA片段膠回收試劑盒回收PCR片段。

 

1.3.2 T載體連接

T載體連接PCR回收片段,按照如下混合:

2×Rapid Buffer 5μl, T載體 1μl, 片段 3μl, T4 DNA Ligase 1μl. 混合后室溫1小時。

1.3.3 轉化

100μlJM109感受態細胞,冰上解凍,取10μl的連接產物混入,冰上靜置30min,然后42℃熱擊90s,迅速放入冰山靜置5min,加入LB培養基,37℃ 150rpm 培養1小時,然后涂布于LA(含50μg/mL的氨卡青霉素鈉),37度培養過夜,第二天菌落PCR鑒定陽性克隆。

1.3.4 陽性克隆鑒定

分別挑取一定數量的克隆,采用菌落PCR方法進行PCR鑒定(方法見1.3.1),同時用LA培養基培養每個克隆。鑒定結果用1%的瓊脂糖鑒定,取能PCR出陽性片段的克隆送測序

1.3.5 測序比對

     使用網絡服務器//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中的Blastn進行比對。


2 結果

上海生物網客服中心
關閉在線客服

Copyright?2015-2020 版權所有 www.qfhtgo.com.cn

滬ICP備15004901號-2